SP 1

Molekulare Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen

Resultate der 1. Förderperiode:
In der 1. Förderperiode haben wir es uns zum Ziel gesetzt, den Nachweis, die Anreicherung und Isolierung der EpCAM+CTCs zu standardisieren. Wir haben erfolgreich ein Protokoll für die Isolierung von CTC aus Blut von Patienten mit einem kolorektalen Karzinom etabliert. Durch einen Dichtegradienten-Zentrifugationsschritt erfolgt die Isolation der mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMCs) und die darin enthaltenen CTCs. Die CTCs werden durch einen fluoreszenzmarkierten Anti-EpCAM Antikörper identifiziert und manuell mit einem Mikromanipulator als Einzelzellen gepickt.

Ein zweites Ziel der 1. Förderperiode war sowohl eine umfassende genetische Charakterisierung der CTCs und dem dazugehörigen Tumorgewebe als auch die Erstellung eines spezifischen Mutationsprofils. In einem ersten Schritt konnten wir mittels Array-CGH Analysen zeigen, dass sowohl der Primärtumor als auch isolierte CTCs ähnliche chromosomale Aberrationen zeigen, womit die CTCs potentiell vom entsprechenden Primärtumor abstammen. Sodann wurden einzelne Hotspot-Mutationen (u.a. BRAF, KRAS, TP53) in Tumorzellen und CTCs auf Einzelzellebene sequenziert. Außerdem konnte in einigen CTCs Mikrosatelliteninstabilität (MSI) festgestellt werden. Des Weiteren wurde das Transkriptom mittels qPCR analysiert. Dabei wurden 47 Gene, die entweder für Stammzelleigenschaften, Migration, Invasion oder Proliferation verantwortlich sind, untersucht. Das Ergebnis zeigte, dass sowohl epitheliale Marker als auch Gene, die mit Migration und Proliferation assoziiert sind, in den CTCs herunterreguliert sind. Wir konnten zeigen, dass CTCs eine sehr heterogene Zellpopulation darstellen und sich diese Zellen während der Zirkulation in einem Zustand der „dormancy“ befinden und sich damit auch dem Immunsystem entziehen können.

Ziele der 2. Förderperiode:
1. Trotz großer Fortschritte in der Einzelzell-Genomanalyse ist eine routinemäßige genetische Charakterisierung von CTCs aus Patienten nicht möglich. Dafür müssten diese raren Zellen in vitro kultivierbar gemacht werden. Deshalb ist eines der Ziele der 2. Förderperiode, geeignete Zellkulturbedingungen für die Proliferation und Langzeitkultivierung von humanen CTCs zu finden.

2. Ein weiteres Ziel ist der Nachweis, dass isolierte CTCs in der Lage sind, sowohl in in vitro- als auch in in vivo-Modellen zu kompletten Tumoren auszuwachsen.

3. Ein drittes Ziel innerhalb dieser Förderperiode ist die umfassende genetische Charakterisierung von disseminierten Tumorzellen (DTCs) aus dem Knochenmark von Patienten. DTCs siedeln sich vom Primärtumor ab und können im Lymphsystem oder im Knochenmark gefunden werden.

Die Metastasierung von epithelialen Karzinomen führt in den häufigsten Fällen zum Tod des Patienten. Für einen erfolgreichen Metastasierungsprozess ist es unerlässlich, dass sich Zellen vom Primärtumor absiedeln, über Blut bzw. Lymphbahn im Körper verteilen, in Sekundärorgane einwandern und schließlich zu Metastasen auswachsen. In der Blutbahn zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind Zellen, die zu so einem komplexen Programm fähig sind. Die prognostische Bedeutung der EpCAM+ CTCs im Blut von Patienten mit einem kolorektalen Karzinom konnte in Studien überzeugend gezeigt werden. Weniger gut verstanden ist jedoch die molekular-genetische Ausstattung dieser speziellen Zellen.

Team SP1, von links nach rechts: Dr. med. U. Bork, Dr. med. S. Schölch, Prof. Dr. med. J. Weitz, S. Ufer, Prof. Dr. med. M. Koch, M.D. S. Garcia, Dr. rer. nat. A. Kempe
Team SP 1

Projektbezogene Schlüsselpublikationen

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